通过创新TFF技术提高连续灌流培养工艺效率
生物制药行业对于连续工艺的关注在不断增加，以通过这种方法提高生产效率和设备利用率。连续工艺已经在其它许多行业成为极其成功的生产模型，且已有特定的连续技术整合到现有的生物药生产流程，显现了诸多优势。而目前，许多商业化生物药生产广泛使用的一种连续工艺技术就是灌流培养。
在多数应用中，灌流培养相比传统批量或补料分批工艺，可提供更多的优势，特别是在不稳定蛋白质的生产中，已应用多年。其主要优势包括改进产品质量和稳定性、更好的可放大性、更高的设备利用率以及成本的降低。
此外，一次性生物反应器的普及也在加快这种趋势，而配用灌流培养技术，可增加“一次性”投入的产出，即通过延长培养时间，提高细胞密度，获得更高的单位体积产率，一般情况下，其效率可达批次培养的10倍甚至更高。而另一方面，目前的一次性生物反应器体积均在2,000L以下，而通过灌流培养技术，可弥补这一缺陷，即达到10倍甚至更高体积反应器的产能。
生物药生产的未来
对于生物药的生产，特别是近25内，连续生产工艺及其相关优势将是主要的被关注点。这些优势包括提供一个更清洁、灵活、高效的生产平台，而FDA及其它监管部门也鼓励将连续工艺应用到生物药生产当中。
连续工艺的驱动力
鼓励生物制药行业将连续工艺整合到生产的一个驱动力是灌流培养在不稳定蛋白质生产中成功的、已经证实的过往经验，如凝血因子和酶。
其它驱动力还包括：
• 更高的单位体积产率
• 封闭系统操作，消除中间性停滞步骤
• 整合式操作 vs. 多单元操作
• 更少的手动操作及更高的自动化水平
这些驱动力主要针对当下传统工艺难以解决的问题，并有利于满足行业未来的发展目标。例如在连续工艺中，各步骤紧密结合，一步紧接一步，而在批量模式中，由于需要使用数个操作单元，所以各步骤间不可避免需要进行物料储存。这些储存步骤使得每一步后的工艺内控制监测尤为关键，加重了QA/QC工作量。而且，这些储存步骤还需要大体积的储存罐，增加生产过程的时间和成本投入。此外，连续工艺由于其本身特性，自动化水平更高，自动化降低了手动操作量，节省了操作员操作作业，也降低了操作错误的风险。
更重要的是，连续工艺可解决多个产品质量和生产灵活性相关问题，如：
产品质量：
• 由于在最佳的稳定状态下操作，可获得高而稳定的产品质量
• 由于细胞活性高，相应降低了杂质水平
• 由于过渡性停滞时间降低，避免产品质量受损
• 使用封闭系统操作，使生物负载风险最小化
• 由于消除了停滞步骤，减少了中间性检测工作
• 与QbD和PAT方法兼容
灵活性：
• 由于设备尺寸更小，所以更灵活
• 与可抛弃性产品兼容
• 更快的生产容量增加/降低调整
• 更短的循环时间，简化物流
• 模块化、标准化的设计及设备占地的降低，更容易向新设备转换
能动技术
将连续工艺整合至整个生物药生产过程的主意还相对较新，所以需要一些能动性技术使其成为可能，而像优化的工艺控制、单次使用产品及细胞截留系统这类技术，使连续工艺在上游成为可能。具体包括：
• 工艺控制
• 单次使用产品
• 设备设计
• 连续下游处理
• 细胞截留系统
• 细胞培养基设计
为了获得从上游到下游完全连续的工艺，下游连续工艺也需要开发，包括多柱层析、在线调节系统以及直通式工艺。
细胞灌流培养
在上游处理中，灌流培养是连续生产的关键组成部分，在绝大多数培养系统中，不管是补料分批还是灌流，培养基都是细胞健康、活性及产率的前体条件，细胞培养基的设计和优化对于使生产达到最高产率极为关键。
绝大部分灌流工艺的开发都以维持恒定的细胞特异性灌流速率（CSPR）为基础，这就形成了两种情况，一种为高CSPR，即细胞培养基没有适应细胞代谢，很多培养未被代谢利用即流出生物反应器。高CSPR要求更高的体积特异性灌流，操作条件非常不经济。而低CSPR意味着细胞培养基基本满足细胞营养需求，但有因营养不足而导致细胞凋亡的危险。所以优化的总体目标是使用高性能的培养基，以较低的CSPR运行灌流工艺。
高性能灌流培养基开发
为优化灌流培养产率，科研人员使用了两种不同的方法进行培养基设计并进行了比较——批量方法及稳态方法。
批量方法
研究人员通过实验筛选设计研究开始批量方法设计，然后在灌流培养运行中对培养基进行验证。结果显示，添加进样溶液可增加培养基性能，最终确认了两种培养基的混合优化组合。通过使用该培养基，在1vvd的体积性灌流速率条件下，维持较低的细胞生长，可获得1g/L的滴度产率。
稳态方法
使用稳态方法时，培养基在灌流培养中进行研究，然后对废弃的培养基进行分析。分析获得了一种新的培养基设计，然后在灌流中进行验证。
在研究过程中，当灌流速率从100pL/c/d降低到25pL/c/d时，科研人员检测了特异性产率和氨基酸消耗速率，同时检测了CSPR对细胞特异性产率及氨基酸消耗的影响，并构建了在不同CSPR下，7种限制性氨基酸的热图。通过这种方法，研究人员设计了一种针对其工艺的高性能灌流培养基。然后，该科研小组在灌流培养中对开发的培养基进行了验证，结果显示，在1vvd的体积性灌流速率条件下，维持较慢的细胞生长，可获得1.5g/L的滴度产率。
案例研究结论
两种方法都可以获得高性能灌流培养基，方法也可用于其它类型细胞培养基的开发。两者都可为高效上游灌流工艺提供一个快速的路径，批量补料设计需时2月，而稳态方法耗时4月。
其它需要考虑的因素：
稳态方法可获得更优化的性能，但耗时是批量方法的两倍。使用稳态开发培养基时，与起始工艺条件相比，细胞特异性灌流速率（CSPR）可降低75%。从结果可知，每细胞培养基消耗可降低4倍，至20pL/c/d。
科研人员经计算推测，以3周的运行时间为例，在细胞密度50 x 107 cells/mL的500L工艺运行中，与原始工艺相比，优化后培养基的用量可节省35,000L以上，从而大大降低成本，即说明开发高性能灌流培养基对提高工艺效率、节省成本的重要性。
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